关键词：
纳米酶
多酚氧化酶
食品分析
邻苯二酚
碱性磷酸酶
多巴胺
摘要：
纳米酶,是指那些具有和天然酶类似的活性的纳米材料,目前已经极大的引起了研究者的关注,旨在解决天然酶和传统人工酶的局限性,并且随着纳米材料的开发研究、生物分析技术以及催化科学的发展取得了突出的成果。多酚氧化酶常存在于动植物体内,也被称为儿茶酚氧化酶、酪氨酸酶或漆酶,是一种含铜的氧化还原酶,能催化单酚羟基化成双酚,催化双酚氧化成醌类化合物,常用于去除污染物质中的芳香污染物。近年来模拟多酚氧化酶的纳米酶研究较少,因此,本文旨在合成模拟多酚氧化酶的纳米酶,并将其应用于食品分析。研究内容主要包括:1.以三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP)、单磷酸腺苷(Adenosine monophosphate,AMP)和单磷酸尿苷(Uridine monophosphate,GMP)为有机配体,与铜(Ⅱ)配位结合形成具有多酚氧化酶活性的纳米酶(ATP-Cu、ADP-Cu、AMP-Cu和GMP-Cu),这类纳米酶同时具有荧光特性,由于激发波长小,纳米酶产生的荧光不易被肉眼观察到,所以将强荧光的半导体聚合物量子点(Semiconducting polymer dot,Pdots)掺杂进AMP-Cu纳米酶中,合成新的荧光纳米复合物(Pdots@AMP-Cu)。我们还将二甲基咪唑与铜(Ⅱ)络合产生二维铜基金属有机框架(2D Cu-MOF),并对合成的纳米酶分别从相同质量浓度、稳定性、动力学参数进行了比较。2.通过纳米酶的比较,发现2D Cu-MOF具有极好的多酚氧化酶模拟活性和稳定性,2D Cu-MOF可以将无色的邻苯二酚氧化成浅黄色,从而产生比色信号,因此基于2D Cu-MOF建立了一种简单快速的邻苯二酚的比色检测方法,吸收强度与邻苯二酚浓度呈线性相关,检测限为3.5μg/mL,该方法用于食品用水中邻苯二酚的检测。3.以核苷酸-Cu纳米酶为基础,对碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性进行了荧光和比色法分析。通过催化2,4-二氯苯酚(2,4-DP)和4-氨基安替比林(4-AP)的显色反应,三种纳米酶(ATP-Cu、ADP-Cu和AMP-Cu)均表现出多酚氧化酶的模拟活性。然而,三种由相同浓度的核苷酸产生的纳米酶(将Cu浓度保持在5 mM)的类多酚氧化酶活性和荧光有明显差异。在核苷酸浓度为3mM时,ADP-Cu和AMP-Cu的催化活性明显高于ATP-Cu。此外,当ALP水解ATP成ADP、AMP,有更多的纳米酶生产,并且体系的催化活性和荧光强度增强,导致比色和荧光信号明显增强。在0-30 U/L范围内,比色信号强度与ALP浓度成正比,比色法检测ALP的检出限为0.3 U/L。此外,所制备的纳米酶的荧光强度在1-30 U/L范围内也与ALP浓度成正比,荧光检测限为0.45 U/L。因此建立了一种基于荧光和比色的ALP检测方法。与蛋白质、氨基酸等干扰组分相比,该方法对碱性磷酸酶活性有较高的选择性。此外,该方法还被用于检测牛奶样品中的ALP活性,显示出很大的实用价值。4.我们开发了荧光纳米酶Pdots@AMP-Cu用于多巴胺(DA)的灵敏和选择性检测。结果表明,DA可以被Pdots@AMP-Cu氧化生成真黑素,同时,由于电子转移,Pdots@AMP-Cu的荧光被真黑素有效猝灭。因此建立了一种新的DA检测方法。观察到荧光猝灭强度与10-400μM浓度范围的DA之间存在良好的线性关系,检测限为4μM,我们建立的这种基于Pdots@AMP-Cu检测DA的方法也可用于人血清中DA的检测。由于这种检测原理是基于DA的酚羟基结构,因此我们推测具有DA类似结构的酚类化合物如肾上腺素、左旋多巴、2,6-二甲氧基苯酚、对苯二酚和莱克多巴胺等,原理上也可被荧光纳米酶灵敏地检测,因此该方法不仅可以用于临床诊断、生物传感、环境监测,还可用作食品质量安全检测等方面,具有良好的应用前景。
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