关键词:
食品添加剂
纳米TiO2
肠道损伤
miRNA分析
mRNA分析
生物信息学
摘要:
二氧化钛(TiO2)是一种白色粉末状颗粒,其存在主要晶型为金红石型、锐钛矿型和板钛矿型,锐钛矿型是使用的主要形式,常用于食品添加剂来改善食品的色泽及口感,其中含有部分(10-50%)纳米级颗粒,通过胃肠道途径在人体中蓄积,会对肠道造成损伤效果。为了研究其对肠道系统损伤作用机理,本文从食品中(口香糖、硬糖)提取出TiO2,并对其进行鉴定和表征,确定其为锐钛矿型纳米TiO2,接着通过体外实验研究人肠道细胞HCT116和NCM460两种细胞暴露于0-200 μg/mL浓度纳米TiO2范围内的影响,结合细胞毒性实验结果,运用高通量测序技术,对纳米TiO2对HCT116细胞中miRNA和mRNA靶基因的表达谱的影响进行了研究,运用生信分析技术,筛选出具有显著差异的miRNA和mRNA靶基因,并运用分子生物学技术对其进行了验证,分析食品添加剂中纳米TiO2对人肠道细胞的影响及其分子作用机理,初步探究了 miRNA靶向调控纳米TiO2对肠道细胞影响的作用机理,加强了对食品添加剂中纳米TiO2的食用安全性安全性认识。本论文的研究可归纳为以下几点:(1)食品中TiO2的提取与表征:利用无水丙酮、无水乙酸和无水乙醇等化学试剂从硬糖和口香糖中提取TiO2,并通过透射电镜、X射线衍射仪和粒度仪进行表征,透射电镜研究发现,所制得的TiO2为纳米级颗粒,形貌特征明显,具有一定团聚性。粒度仪结果显示纳米级颗粒粒径分布约占10-15%,X射线衍射结果与标准PDF卡片比较,证明所提取白色粉末为TiO2且其结晶度高,晶相结构为锐钛矿型。(2)纳米TiO2对肠道细胞毒性作用:采用Cell Counting Kit-8细胞计数试剂盒检测、细胞活性氧检测、乳酸脱氢酶检测、细胞克隆实验等方法检测纳米TiO2在0-200μg/mL浓度范围内对两种肠道细胞的毒性影响。前期研究表明,在100-200 μg/mL范围内,纳米TiO2可显著抑制HCT116细胞的生长,并影响其迁移和克隆性,而NCM460细胞则不受影响。然而,200 μg/mL的TiO2对小肠粘膜上皮细胞的影响却不明显。表明较高浓度纳米TiO2可能对结肠细胞产生损伤作用,影响肠道生命活动。(3)miRNA/mRNA组学研究:基于纳米TiO2对HCT116细胞的损伤效应,运用高通量测序技术检测了 100 μg/mL和160μg/mL两种不同浓度纳米TiO2处理前后结肠癌组织中miRNAs及mRNAs的表达变化,筛选出与TiO2处理后相关的miRNAs及mRNAs,并利用GO技术对其下游的miRNAs及mRNAs进行功能验证。研究表明,纳米TiO2对结肠细胞损伤会引起一系列miRNAs的显著差异表达,这些miRNAs主要与细胞代谢、信号转导、细胞增殖、分化等生命进程有关。经过分析得到了 232(100μg/mL)和335(160 μg/mL)个显著差异表达的miRNA,之后进一步从差异表达显著且靶基因与细胞生长、代谢以及细胞周期、凋亡相关的miRNA中筛选出了 miR-142-3p、miR-142-5p、miR-150-5p、miR-24-3p、miR-195-3p、miR-143-3p、miR-199a-5p 等显著差异miRNAs。同时,对纳米TiO2诱导的HCT116细胞中mRNA的表达谱展进行研究,结果显示:低浓度(100 μg/mL)和高浓度(160μg/mL)纳米TiO2在作用细胞48 h后,分别获得360个和1211个差异表达明显的mRNA,其主要影响的是人类疾病类别,影响细胞进程的差异基因主要表现为细胞生长、凋亡等相关通路,涉及环境信息的差异基因主要影响信号转导、信号分子等相关通路。从显著差异基因中筛选出p53、p21、PI3K、AKT、Bax、SMAD4、TGF-β等相关基因,并与 miRNA 相连,构建miRNA/mRNA靶基因调控轴(4)分子机制的验证:通过RT-qPCR与Western blot验证检测差异miRNA和mRNA靶基因在结肠癌细胞HCT116中的表达量,研究结果发现miRNA RT-qPCR结果与 miRNA 表达谱分析结果一致,其中 miR-142-3p、miR-142-5p、miR-150-5p、miR-143-3p和miR-199a-5p均呈明显上调,而miR-24-3p和miR-195-3p呈现显著下调的趋势。mRNA差异基因表达量与mRNA表达谱结果一致,结果显示p53、p21、Bax基因在HCT116细胞纳米TiO2暴露后,其表达量上调,肠道细胞受到损伤;TGF-β和Smad4基因表达量也均呈上调趋势,表明纳米TiO2可能通过影响miRNAs进而影响TGF-β/Smad4、p53/p21和PI3K/AKT调控轴来对肠道细胞产生损伤效果。