关键词:
人星状病毒
污水
环境监测
二代测序
系统发生
摘要:
人星状病毒(HAstV)是无包膜的单正链RNA病毒,是导致全球儿童急性胃肠炎的常见病毒之一,也有研究认为其与免疫力低下患者的中枢神经系统疾病如脑膜炎、脑炎有关。HAstV包括经典型HAstV-1~-8型和最近发现的新型HAstV-MLB和HAstV-VA型。大量研究表明,环境污水监测是了解监测地区人群中胃肠炎病毒流行情况和多样性的有效方法,是不依赖临床病例监测的重要监测手段。然而,目前还缺乏对环境污水中经典型和新型HAstV的综合性研究。近年来,扩增子二代测序(Next generation sequencing,NGS)技术在胃肠道病毒的环境污水监测中开始得到应用,其针对污水浓缩液PCR扩增阳性产物进行NGS测序,大大丰富了污水中的病毒谱。本研究在2018~2021年期间每月于山东省济南市光大污水处理厂采集污水样本,与以往的集中于HAstV ORF1b或ORF2的部分区域不同,本研究的扩增区域为ORF2全长编码区,因此将获得更为全面的序列信息,在此基础上开展序列分析,探索污水中HAstV型别分布和时间动态变化特征,以期为胃肠炎疾病的预防控制和预警机制的建立提供科学依据。研究目的1.基于ORF2全长编码区扩增NGS技术,探索山东省济南市2018~2021年环境污水中经典型HAstV和新型HAstV的型别分布。2.通过对环境污水中HAstV流行信息的收集与分析,补充临床病例监测资料,从而获取全人群流行资料,进而探究其长期循环动态变化。3.通过对山东省济南市HAstV与国内外其他地区型别进行系统发生学分析,提高对HAstV传播的认识。研究方法1.环境污水的采集与浓缩:2018~2021年共采集济南市光大污水处理厂进口处污水48份,使用阴离子膜吸附洗脱加超声波震荡法对其进行富集浓缩。2.病毒核酸提取:按照MagMAX病原体RNA/DNA提取试剂盒说明书操作,手动操作提取病毒核酸。3.病毒核酸的扩增与测序:RT-PCR扩增HAstV ORF2全长编码区基因片段,阳性产物经NGS测序,对产生的干净数据使用CLC Genomics Workbench 12.0软件de novo组装后,进行基因定型。4.相似性分析与系统发育学分析:采用BioEdit7.***.9.0软件进行相似性分析;使用MEGA 11.0软件,构建系统发生树。主要结果***的检出情况研究期间共采集生活污水48份,40份为HAstV阳性,阳性率83.3%。共获得94个扩增子,经NGS分析共检出16种HAstV,包括经典型HAstV(-1~-6、-8),HAstV-MLB(MLB1~MLB3)和 HAstV-VA(VA1~VA6)。其中 3 种经典型 HAstV(HAstV-1、HAstV-3和HAstV-4)在HAstV阳性的污水样本中均被检测到。本研究在22.5%(9/20)的污水样本中检测出与VA分支同源的新型别VA6,共获得VA6ORF2全长序列9条,其与最接近的毒株VA5的核苷酸相似性为82.3%~83.3%。2.基于ORF2全长编码区的相似性比较和系统发育分析根据本研究检出的HAstV型别相似性分析显示,同一型别的山东株相似性最高,系统发育分析显示,HAstV-1、HAstV-2、HAstV-3、HAstV-5、VA1山东株被分为2个或2个以上的遗传谱系,存在多个共循环的传播链。此外,还发现了一支大部分由山东株序列组成的新型别谱系VA6。所有型别的山东株在系统进化树上均聚集在同一型别内。主要结论1.2018~2021年山东省济南市环境污水中检出了多种型别的HAstV,包括新型别VA6和MLB2、MLB3等较为罕见的型别,型别谱显著丰富。2.基于NGS的环境监测极大提高了对HAstV传播的认识,应建立专门的HAstV环境监测系统,以结合临床病例监测资料,充分了解和掌握其在人群中实际循环传播情况。***-1、HAstV-2、HAstV-3、HAstV-5、VA1山东株在监测人群中存在不同进化分支的共同流行情况。本研究获取的山东株表现出明显的空间及时间聚集性。