关键词：
m5C甲基化修饰
m5C结合蛋白
脱氨酶
摘要：
5-甲基胞嘧啶（m5C）甲基化修饰是重要的转录后修饰,它已被验证在RNA中广泛存在,是近年来表观遗传学领域的研究热点之一。m5C修饰主要由甲基转移酶、去甲基化酶和结合蛋白动态调控,几乎参与了RNA代谢的所有重要阶段,并且m5C的动态变化在许多生理和病理过程中都具有重要影响,与多种疾病的发病机制密切相关。因此,对RNA m5C甲基化水平的检测具有重要意义。
但是,现有的RNA m5C修饰的检测方法仍存在诸多问题,如样本需求量大、化学处理对机体或者RNA有损害、抗体依赖性强,准确度和敏感性较差等,这些问题极大地限制了RNA m5C甲基化修饰相关的研究进展。因此,亟待开发新的检测系统以更为准确、高效、便捷地检测m5C修饰水平变化。
本研究基于脱氨酶开发了一种新型m5C检测方式——DRAM（deaminase and m5C reader-assisted RNA methylation sequencing approach）。通过将脱氨酶（APOBEC1和Tad A-8e）与m5C结合蛋白（ALYREF和YBX1）融合,特异性地识别m5C位点并介导位点附近产生点突变,来实现位点特异性的m5C检测。为了排除m5C结合蛋白非m5C特异性结合导致的假阳性结果的产生,我们将m5C结合蛋白中负责识别并结合m5C修饰的关键氨基酸进行突变,构建出DRAMmut系统。只有在DRAM的诱导下产生的脱氨变化与在DRAMmut或Deaminase诱导下产生的脱氨变化存在差异时,我们才认为附近存在m5C修饰。主要研究内容和结果如下:
首先,本研究成功构建了DRAM m5C检测系统载体,并在转染后对m5C位点进行检测。结果显示,在DRAM系统的诱导下,m5C位点附近会产生明显的C-to-U或A-to-G的转换,相比于DRAMmut和Deaminase诱导产生的突变存在显著差异,即DRAM系统能够有效识别m5C区域。接下来为了验证DRAM系统特异性地对m5C位点附近的胞嘧啶/腺嘌呤进行脱氨,我们利用CRISPR-Cas9基因敲除技术获得了NSUN2和NSUN6缺失的HEK293T细胞系,与野生型细胞相比,甲基转移酶缺失后m5C位点附近的脱氨效率显著降低,几乎不存在有效突变,这些发现表明DRAM检测系统以m5C依赖的形式进行m5C检测。
随后,结合高通量测序分析（DRAM-seq）,我们探究了DRAM能否在全转录组范围内进行m5C检测。结果显示,在多个高置信度m5C位点附近都存在DRAM-seq编辑事件,而在甲基转移酶缺失的细胞中,DRAM-seq的总体编辑事件极少。这些结果进一步证实了DRAM系统可以m5C依赖的方式进行全转录组范围内的m5C检测。进一步分析DRAM-seq结果的数据特征发现越靠近m5C位点的碱基被编辑的可能性越大,DRAM-seq的编辑窗口约为40 nt。DRAM-seq检测结果表明,m5C甲基化修饰主要集中在CDS区,带有m5C修饰的基因参与了翻译、m RNA剪接、细胞周期调控和DNA损伤修复等多种关键的生物过程,具有重要的生物学功能。
最后,本研究对DRAM检测系统进行了综合评价。通过将DRAM-seq结果和已报道的两项m5C亚硫酸氢盐测序（BS-seq）数据结果进行对比后发现,DRAM-seq和BS-seq的检测数据高度重叠,并且一些关键调控因子如ATG16L1、ARHGEF25、FANCD2和RPL15无法同时被两项m5C公开数据所覆盖,但却能够被DRAM-seq稳定地检测到,这说明DRAM系统能够准确检测m5C修饰。此外,用亚砷酸钠处理表达DRAM的细胞发现,m5C水平降低后DRAM系统的编辑效率也显著降低,由此证明DRAM能够监测细胞RNA中m5C的动态变化。其次,我们还发现,250 ng、50 ng和10 ng的不同总RNA模板量观测到的DRAM编辑效率不存在显著差异,即DRAM支持微量样本的m5C检测。另外,CCK8检测发现,DRAM不会影响细胞的相对增殖能力。
综上所述,我们成功开发了一种基于脱氨酶的新型RNA m5C检测方法,该方法无需化学处理,不依赖抗体,可以实现全转录组范围内的m5C检测。此外,DRAM系统支持微量样本（10 ng总RNA）的m5C分析,并能监测m5C的动态变化,为揭示更多m5C修饰的生物学功能和开发相关疾病的药物奠定了基础。
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