关键词:
蛋白激酶C
辐射损伤
巨核细胞
血小板
细胞凋亡
摘要:
[目的]电离辐射被广泛用于临床诊疗、工业检测等领域,接受放疗的部分患者和长期处于辐射环境的工作人员会出现贫血、血细胞减少等症状。骨髓对电离辐射高度敏感,骨髓中巨核细胞凋亡是影响血小板数量和功能的重要生理因素之一。蛋白激酶C(PKC)作为辐射效应蛋白之一,在电离辐射引起的细胞凋亡调控中发挥重要作用。巨核细胞凋亡参与电离辐射致血小板减少的作用及调控机制报道较少,尚无围绕PKC通路调控该过程的相关研究。本文旨在探讨PKC通路如何参与辐射引起的血小板减少及其相关调控机制,可为电离辐射致血小板减少症的发生发展及诊疗提供一种新的研究思路。[方法]体外实验:本研究选取人原始巨核细胞系CMK细胞进行体外实验。Go6983是一种PKC泛抑制剂,能够抑制多种PKC亚基。在CMK细胞受照射前用含不同浓度Go6983的培养基孵育,CCK-8法检测照射后CMK细胞增殖。分别使用FITC-Annexin V/PI、JC-1、DCFH-DA、FITC-CD41/PI标记CMK细胞,流式细胞术检测CMK细胞受照射后凋亡、线粒体膜电位、细胞内活性氧以及多倍体情况。Western blot法检测CMK细胞受照射后 p-PKC 底物、caspase3、cleaved caspase3、p-p38、p-p53 等蛋白的表达情况。体内实验:C57BL6/J小鼠经灌胃给予Go6983,分别在给药前和给药后采集全血进行血小板计数,使用全血洗涤血小板,检测血小板聚集、P-选择素表达、线粒体膜电位变化以及PS暴露情况。使用半致死剂量3 Gy X射线对小鼠进行全身照射,分别在照射前和照射后灌胃给予Go6983,检测不同时间点血细胞数量。另采用致死剂量6 Gy X射线对小鼠全身照射,观察小鼠生存率,同时在照射后每组随机选取小鼠,经解剖后分离小鼠骨髓,流式细胞术检测骨髓内巨核细胞凋亡率、CD41阳性率以及巨核细胞多倍体情况,另取小鼠胫骨进行HE染色,观察骨髓内细胞情况,并统计巨核细胞数目。[结果]Go6983促进X射线照射后CMK细胞的增殖,在50nM到200nM浓度范围内呈现剂量效应关系。流式细胞术结果显示,Go6983预处理CMK细胞,可以显著抑制X射线诱导的CMK细胞凋亡、线粒体膜电位和胞内ROS水平,并促进CMK细胞多倍体的形成。Western blot结果显示,X射线能够促进CMK细胞的p-PKC底物、p-p38、cleaved caspase3、p-p53等蛋白的表达。与单独辐照组相比,Go6983显著降低了 p-PKC底物、p-p38、cleavedcaspase3等蛋白的表达,而p-p53表达未发生改变。进一步研究显示p53抑制剂Pifithrin-β hydrobromide预处理CMK细胞可降低照射后p-PKC底物的表达。体内实验结果显示,与对照组相比,给药Go6983后小鼠体内血小板计数增加,而该剂量Go6983对血小板功能未产生不良影响。3GyX射线全身照射后,Go6983组小鼠血小板恢复情况显著改善,21天后血小板计数恢复正常。6 Gy X射线全身照射后,Go6983组小鼠存活率显著增加,与单独辐照组相比,Go6983组小鼠骨髓巨核细胞凋亡率显著下降,骨髓内CD41阳性细胞比例显著上升,多倍体比例升高,小鼠胫骨HE染色结果显示给药后小鼠骨髓巨核细胞数目显著增加。[结论]***6983能够促进X射线照射后CMK细胞的增殖,抑制X射线诱导的CMK细胞凋亡、线粒体膜电位改变以及ROS生成,并促进CMK细胞多倍体成熟。2.X射线可激活巨核细胞中PKC,Go6983能够抑制X射线引起的PKC激活、cleaved caspase3以及p-p38的表达,X射线引起的PKC激活可能受到p53通路的调控。***6983可恢复X射线致小鼠体内血小板计数的下降,抑制骨髓内巨核细胞凋亡,并促进骨髓内巨核细胞多倍体的形成,降低致死剂量辐射引起的小鼠死亡率,且不影响小鼠体内血小板功能。