关键词:
恶性黑素瘤
外泌体
胰岛素样生长因子结合蛋白7
人脂肪间充质干细胞
摘要:
目的研究A375细胞对胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7,IGFBP7)转染的人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)外泌体(ADSCs;IGFBP7;外泌体)的摄取能力以及摄取后凋亡情况的影响,为恶性黑素瘤的基因治疗提供新的思路。方法采用组织块贴壁培养法,将脂肪干细胞原代培养至第2代,采用细胞爬片免疫荧光法进行细胞表面标记物的鉴定。将购买的IGFBP7-GFP过表达载体转染至ADSCs细胞,构成ADSCs;IGFBP7;细胞,荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测其IGFBP7 mRNA水平。提取外泌体,用电子显微镜分析其超微结构,并用免疫印迹(Western blot)法鉴定CD63、CD81蛋白的表达。将ADSCs;IGFBP7;外泌体作用于A375细胞,用荧光显微镜观察A375细胞摄取ADSCs;IGFBP7;外泌体的能力,用流式细胞仪检测A375细胞的凋亡情况。结果细胞爬片免疫荧光结果示,分离出的细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达,提示分离培养的细胞符合脂肪间充质干细胞的特异性表型。与对照组相比,转染组的IGFBP7 mRNA表达增高(t=11.50,P<0.01),提示IGFBP7-GFP过表达载体转染至ADSCs细胞,构成ADSCs;IGFBP7;细胞。透射电镜下可见外泌体具有较明显的异质性,发现ADSCs;IGFBP7;外泌体形态呈大小不一的球膜结构,中间颜色较深,边缘处有低密度物质;Western blot结果示,外泌体标志蛋白CD63、CD81均阳性表达,提示外泌体提取成功。与A375细胞组相比,将ADSCs;IGFBP7;外泌体与A375细胞共同培养,用PKH26标记外泌体,6 h后A375细胞在摄取ADSCs;IGFBP7;外泌体。A375细胞组、A375细胞+ADSCs;IGFBP7;外泌体组的A375细胞凋亡率分别为(0.743±0.050)%、(4.990±0.196)%。A375细胞+ADSCs;IGFBP7;外泌体组凋亡率升高,与A375细胞组相比差异有统计学意义(t=20.93,P<0.001)。结论ADSCs;IGFBP7;外泌体可被A375细胞摄取并促进其凋亡。