关键词:
细胞周期检验点激酶2
Beclin1
自噬
DNA损伤修复反应
摘要:
目的:细胞自噬是细胞对于有害或者衰老的自身成分进行降解和清除的行为,是生物进化过程中高度保守的自我吞噬过程,对于维持细胞稳态和机体平衡起到重要作用。在代谢应激条件下,细胞可以通过自噬反应及时清除细胞内的有害成分并通过此过程为细胞提供能量和其生存的必要物质来维持细胞内稳态。细胞周期检验点激酶2(Checkpoint Kinase2,Chk2)作为DNA损伤修复应答反应信号通路中重要的一员,在DNA损伤与修复中发挥极其重要的作用,我们近期的研究还发现,Chk2还参与细胞在代谢应激条件下自噬的发生,揭示了Chk2在自噬调控中的重要作用。通过进一步的研究,我们还发现,在众多自噬相关蛋白中,酵母自噬相关基因6(Autophagy-related gene 6,Atg6)的同系物Beclin 1在代谢应激条件下可以与Chk2结合增强,且作为丝苏氨酸激酶的Chk2可以通过磷酸化Beclin 1来调节自噬过程。因此,在本研究中,我们将致力于进一步探讨Chk2参与细胞在代谢应激条件下细胞自噬发生的信号通路,阐明其调节自噬的分子机制,可以为DNA损伤修复应答反应和细胞自噬行为间的交互对话提供理论依据。方法:1.利用人肺腺癌H1299细胞系和小鼠胚胎成纤维细胞明确Chk2在细胞自噬中的作用,比较代谢应激条件下细胞自噬水平的差异。2.通过免疫共沉淀实验探索Chk2在代谢应激条件下调控细胞自噬的生理性底物。3.通过体外激酶实验进一步明确了Chk2磷酸化Beclin 1的具体磷酸化位点,并生产位点特异性的磷酸化抗体,在细胞内分别过表达或沉默Chk2,观察Beclin 1的位点磷酸化情况,从而确定在代谢应激条件下,活化的Chk2可以磷酸化Beclin 1的S90/S93位点。4.通过蛋白质免疫印迹和免疫共沉淀等手段证实Chk2磷酸化Beclin 1参与细胞自噬的分子机制。结果:***2参与调控代谢应激条件下的细胞自噬发生。***2调节自噬的生理性底物为Beclin 1。3.代谢应激条件下,Chk2会磷酸化Beclin 1 S90/S93位点4.代谢应激条件下,Chk2可以通过磷酸化Beclin 1减弱Beclin 1与Bcl-2之间的结合并促进细胞自噬。结论:1.细胞周期检验点激酶2即Chk2参与调控自噬过程。2.活化的Chk2可以磷酸化Beclin 1 S90/93位点抑制Beclin 1与Bcl-2之间的结合。3.活化的Chk2磷酸化Beclin 1 S90/93位点促进自噬进程。