关键词:
葡萄糖-6-磷酸酶
葡萄糖激酶
原核表达
多克隆抗体
大口黑鲈
摘要:
为深入研究营养因子调控大口黑鲈(Micropterus salmoides)葡萄糖稳态的分子机制,研究成功克隆并构建了大口黑鲈葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基(G6pc)和葡萄糖激酶(Gck)截短序列的重组质粒载体,转化至Escherichia coli Rosetta感受态细胞并以1 mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、16℃诱导表达过夜,在细胞破碎后的上清中得到了大量表达。通过GST-tag亲和层析的方法纯化得到高纯度的G6pc和Gck截短重组蛋白后,将其分别与弗氏佐剂乳化成免疫原,免疫KM小鼠5次,成功制备具有高特异性和高效价的多克隆抗体(G6pc和Gck抗体的效价分别大于1﹕3000和1﹕10000)。Westen blot检测发现大口黑鲈G6pc和Gck蛋白主要分布在肝脏中,免疫荧光染色显示G6pc的阳性信号定位于细胞核周围,而Gck的阳性信号散布整个细胞。在8周养殖实验结束后,随饲料淀粉水平以6%的梯度从8%增加到20%,大口黑鲈肝脏中糖酵解和糖原合成关键酶编码基因的表达及Gck水平逐渐升高,但糖异生和糖原分解关键酶编码基因的表达及G6pc水平仅在14%淀粉水平时被抑制,意味着在高淀粉水平(20%)下大口黑鲈肝脏中葡萄糖-G6P间的相互转化发生了无效循环。综上所述,研究成功制备了大口黑鲈G6pc和Gck特异性识别的多克隆抗体,探明了饲料淀粉水平对其表达的影响,为深入研究G6pc和Gck在大口黑鲈葡萄糖稳态维持过程中的重要作用奠定了基础。